【微光譜應用】如何使用紫外吸收測量蛋白質濃度

介紹

蛋白質是生命的中心。 這些錯綜復雜的生物分子在細胞過程，新陳代謝，催化生物化學反應和作為結構元素等方面發揮著重要作用，甚至更多。 作為所有生命的重要元素，蛋白質往往是生物醫學診斷研究和生命科學研究的主要研究內容。 不管所尋求的答案或蛋白質來源如何，涉及蛋白質的大多數研究開始于量化樣品中存在的蛋白質的量。

蛋白質濃度定量

定量蛋白質濃度的方法分為兩組 - 使用UV吸光度的直接檢測，或使用與蛋白質反應以制備有色產物，并對其進行比色可見吸光度分析。 在280nm處的直接吸光度測量 - 其中芳族氨基酸：色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸吸收 – 這種檢測相對較快，并且不用消耗蛋白質。 使用試劑的比色測定可提供總蛋白質濃度，但蛋白質雜質可能會影響測量結果。

不管用于蛋白質定量的確切方法如何，第一步都是測量感興趣蛋白質或標準蛋白質的幾種稀釋度的吸光度。 在直接紫外吸收法的情況下，將280nm處的吸光度相對于每個樣品的已知濃度繪圖。 根據比爾定律（也稱為比爾朗伯定律），溶液的吸光度直接取決于吸收分子的濃度和光線通過樣品的光程。 這種關系使我們能夠使用為我們已知的蛋白質樣品生成的標準曲線來確定未知蛋白質樣品的濃度。

比爾定律規定...

...其中

A（λ）是溶液對波長的吸光度值
ε（λ）是作為該波長下的吸收分子的摩爾吸光系數或消光系數（L / mol·cm）
c是溶液的濃度（mol / L）
l是光通過溶液所經過的光程（cm）

未知蛋白質濃度由通過數據點繪制的最佳擬合線進行確定。 請注意，標準曲線的線性部分是唯一用于確定未知樣品濃度的區域。 測量值超出標準曲線線性范圍的樣品必須稀釋，直到吸光度落在線性范圍內。 基于測量濃度范圍之外的數據或超出圖的線性區域的濃度預測無效。

我們使用配置用于UV吸光度測量的 Ocean HDX光譜儀來生成牛血清白蛋白（BSA）的標準曲線。  Ocean HDX的高分辨率光學元件使其成為UV吸光度測量的理想選擇，并具有超低雜散光以獲得更高的最大吸光度水平，另外升級了的光學元件，可在緊湊的空間內提供卓越的性能。

實驗步驟

用水作為溶劑制備6mg / mL BSA（Sigma P/N A2153）儲備溶液并稀釋至0.02mg / mL，用于制定預測未知蛋白質樣品濃度的標準曲線。值得我們的注意的是，BSA經常用作生成校準曲線以預測蛋白質濃度的標準蛋白質。

使用OCEAN-HDX-UV-VIS光譜儀，DH-2000-BAL平衡氘鎢光源，CUV-UV比色皿支架，QP230-2-XSR極度抗紫外光纖兩根，并使用OceanView中的吸光度向導進行吸光度測量。 由于BSA不在可見光區域產生吸收，因此我們只需使用氘燈用于測量。 將光源限制在發生吸光度的區域會減少測量中的雜散光，從而為更高濃度的樣品提供更高的最大吸光度水平。 光譜儀和光源預熱60分鐘，通過消除光譜儀和光線升溫至一致溫度時發生的漂移，提高測量的穩定性。

測量是在一個石英比色皿中進行的，該比色皿在測量之間未從比色皿支架上取下。 通過取出0.5mL樣品并用0.5mL水替換它，可實現直接在比色皿中進行稀釋。 在將水添加到比色皿之后，使用一次性移液管來混合樣品，進行稀釋至0.02mg / mL。

結果

下面的圖1顯示了使用Ocean HDX測量的蛋白質吸收光譜。  Ocean HDX的超低雜散光性能使我們能夠測量280 nm處芳香族氨基酸峰的吸光度，幾乎達到3 AU。 注意，測量肽主鏈在220nm附近吸收的區域的吸光度值超過3AU（數據未顯示）。

圖1：在水中稀釋的BSA的吸光度。 根據比爾定律預測，吸光度在儀器的線性范圍內隨濃度線性增加至?2.5 AU。

由BSA吸光度數據產生的標準曲線如圖2所示。在2.4和2.5 AU之間觀察到數據的平衡或滾降。 此滾降表示測量中存在雜散光。 雜散光（以不同程度存在于所有吸光度測量中）限制了系統可測量的最大吸光度值。

 雜散光是來自設計光路外部的光線，無意中落在探測器的任何部位，從而產生錯誤的讀數。 檢測器不區分檢測器給定像素上的波長，它只是測量撞擊檢測器的光強度。 由于這個原因，如果光線在探測器上不應有的像素（波長）處著陸，探測器將錯誤地輸出該波長的讀數。 這種雜散光通常來自預期的光源，但在光譜儀內散射并落在檢測器的錯誤部分，但它也可能完全來自不同的源。 該燈設置系統可實現的最大吸光率的工作限制，并通過限制系統的黑暗程度來降低信噪比。 雜散光的常見來源包括光柵中的高階反射，光柵中的缺陷，光譜儀內部的反射以及光譜儀外殼中的光泄漏。  Ocean HDX擁有在改尺寸下最小的雜散光和可測量的最大吸光度水平。

圖2：BSA標準曲線包括0至6mg / mL濃度的超過30個數據點。 請注意在2.4到2.5AU之間的光譜的滾降或流平，其中雜散光限制最大吸光度。

在圖3中，來自最高蛋白濃度的數據點已經從圖中去除以評估測量的線性范圍。 如R2值的改善，表明該線的方程式更適合并且將提供更準確的蛋白質濃度值，但是在2.5 AU下仍然有一些滾降。其他在4到4.5AU之間的吸光度，需要額外測量來評估該區域的線性。

圖3：吸光度測量的近似線性范圍的BSA標準曲線。

使用該圖，使用最佳擬合線的方程計算未知BSA或其他蛋白質樣品的濃度，其中y是未知樣品的吸光度值。

結論

標準曲線（也稱為校準曲線）的是許多生物醫學，診斷和生命科學研究實驗室中的典型應用。 準確測定蛋白質濃度是涉及蛋白質分析的第一步。 憑借超低雜散光，升級的光學元件和高紫外靈敏度， Ocean HDX非常適合測量紫外吸光度，包括確定未知蛋白質濃度所需的測量。